Späť

In vitro kultivácia potkaních Schwannových buniek u dospelého tkaniva

In vitro cultivation of rat Schwann cells from adult tissue

Mgr. Peter Tomko
Univerzita Pavla Jozefa Šafárika v Košiciach, Prírodovedecká fakulta
Ústav biologických a ekologických vied
Moyzesova 11, 040 01 Košice

Abstrakt:
Cieľom našich experimentov je príprava autológnych Schwannových buniek (SCs) in vitro z dospelých potkanov pre mikrotransplantačné štúdie. Vo väčšine publikovaných metód bol využívaný sedací nerv ako zdroj periférneho nervového tkaniva, pretože je to najväčší periférny nerv u potkana. V našej štúdii sme použili stredový nerv, pretože jeho odobratie má minimálny neurologický dopad na potkana. Aby sme boli schopní vyprodukovať dostatočné množstvo SCs v čo najkratšom čase, použili sme metódu publikovanú Komiyawa et al. (2003). Stredový nerv bol chirurgicky izolovaný a prerušený v proximálnej časti. Rana bola chirurgicky uzavretá a prerušený nerv degeneroval počas siedmych dní in vivo. Po siedmych dňoch bol nerv odobratý (približne 10mm). Nerv bol nasekaný na drobné kúsky a tkanivo bolo spracované pre kultúry SCs. Fragmenty nervov boli natrávené a centrifugované. Bunková kultúra je pestovaná zmenou koncetrácie fetálneho bovinného séra (FBS) od 0 do 10%.Táto metóda je použitá pre zamedzenie prerastaniu fibroblastov. Prvé tri dni sú fragmenty pestované s DMEM s 10% FBS. Ďalšie tri dni sú pestované s DMEM bez FBS. Po týchto troch dňoch sú fragmenty odobraté a bunky sú pestované s DMEM s 2,5% FBS. Fragmenty sú nasadené do ďalšej misky a procedúra sa opakuje. Kultúra SCs hotová po 21 dňoch. Tento protokol je veľmi jemný, lebo nepoužíva žiadna mitogény alebo inhoíbítory rastu fibroblastov. Avšak v našich podmienkach SCs dosahujú menej ako 50% a nevytvárajú súvislú vrstvu po 21 dňoch. Množstvo SCs vyprodukované z jedného stredového nervu je dostatočné pre mikrotransplantačné štúdie. Avšak, pre masovú produkciu autológnych SCs z dospelého tkaniva by mal byť použitý protokol, ktorý využíva mitogénmi stimulovanú proliferáciu.

Kľúčové slová:
Schwannové bunky, in vitro, mikrotransplantácie, bunkové kultúry, periférny nervový systém

Abstract:
The aim of our experiments was preparation of autologous Schwann cells (SCs) in vitro from adult rats for microtransplantation studies. Most of the techniques published in the past used sciatic nerve as a source of peripheral nerve tissue, as it is the largest peripheral nerve in the rat. In our study, we have used a median nerve, as its resection causes minimal neurological consequences in the rat. In order to produce sufficient amount of SCs in the shortest period of time, we have used a method published by Komiyawa et al. (2003). The median nerve was surgically isolated, and transected at its proximal part. The wound was surgically closed and the transected nerve was allowed to degenerate for 7 days in vivo. After 7 days, the nerve was resected (approx.10 mm). The nerve was cut into small pieces and the tissue was processed for Schwann cell culture. Nerve fragments were digested and centrifuged. Cell culture is treated by altering concentrations of fetal bovine serum (FBS) from 0 to 10%. This method is used to prevent fibroblast overgrowth. First three days are fragments cultured with DMEM with 10% FBS. For another three days they are cultured with DMEM without FBS. After these three days fragments are removed and the cells are cultured with DMEM with 2,5% FBS. Fragments are planted to another dish and the procedure is repeated. Culture of SCs is complete after 21 days. This protocol is very gentle, as it uses no mitogens or inhibitors of fibroblast growth. However, in our hands the SCs comprised less than 50% and did not form a confluent layer within 21 days. The amount of SCs produced from one median nerve is sufficient for microtransplantation studies. However, for mass production of autologous SCs from adult tissue, protocols using mitogen-stimulated proliferation should be used.

Keywords:
Schwann cells, in vitro, microtransplantation, cell cultures, peripheral nerve system

Späť